本发明公开了一种无泵固定斑马鱼微流体芯片系统及其制备方法与应用，所述无泵固定斑马鱼微流体芯片系统包括输送装置、斑马鱼微流控芯片、光敏水凝胶、光源装置、分析装置。该系统能通过流体动力学方法，芯片微结构设计和凝胶微阀阻隔的结合，在不进行长期麻醉处理和持续性水流注射的情况下实现对斑马鱼的自动化固定。而且该系统可实现高通量、自动化，能为进一步实现复杂疾病治疗药物的研发，以及斑马鱼相关研究提供了极具潜力的技术支持。

  (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 CN 112452362 B (45)授权公告日 2021.09.21 (21)申请号 2.5 (56)对比文件 (22)申请日 2020.09.25 US 8101069 B2,2012.01.24 JP 4522587 B2,2010.08.11 (65)同一申请的已公布的文献号 WO 2010149292 A1,2010.12.29 申请公布号 CN 112452362 A CN 108359577 A,2018.08.03 (43)申请公布日 2021.03.09 CN 203235494 U,2013.10.16 (73)专利权人 中山大学 CN 105229466 A,2016.01.06 地址 510000 广东省广州市番禺区外环东 Min Peng.Development of a two-photon 路132号 fluorescent probe to monitor the changes of viscosity in living cells, zebra fish (72)发明人 林旭东唐明卉 and mice.《Spectrochimica Acta Part A: (74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有 Molecular and Biomolecular Spectroscopy》 限公司 44205 .2019,第224卷 代理人 胡辉 蔡亚梅.微流控芯片技术在药物活性研究中 的应用进展.《药物分析杂志》.2013,第33卷(第 (51)Int.Cl. 11期), B01L 3/00 (2006.01) 审查员 查抒言 权利要求书1页 说明书10页 附图10页 (54)发明名称 一种无泵固定斑马鱼微流体芯片系统及其 制备方法与应用 (57)摘要 本发明公开了一种无泵固定斑马鱼微流体 芯片系统及其制备方法与应用，所述无泵固定斑 马鱼微流体芯片系统包括输送装置、斑马鱼微流 控芯片、光敏水凝胶、光源装置、分析装置。该系 统能够最终靠流体动力学方法，芯片微结构设计和 凝胶微阀阻隔的结合，在不进行长期麻醉处理和 持续性水流注射的情况下实现对斑马鱼的自动 化固定。而且该系统可实现高通量、自动化，能为 进一步实现复杂疾病治疗药物的研发，以及斑马 鱼相关研究提供了极具潜力的技术上的支持。 B 2 6 3 2 5 4 2 1 1 N C CN 112452362 B 权利要求书 1/1页 1.一种无泵固定斑马鱼微流体芯片系统，其特征是，所述无泵固定斑马鱼微流体芯 片系统包括输送装置、斑马鱼微流控芯片、光敏水凝胶、光源装置、分析装置； 其中，所述光敏水凝胶用于在芯片中辅助固定斑马鱼幼苗或斑马鱼鱼卵； 所述斑马鱼微流控芯片具有若干个微型结构单元；所述微型结构单元依次设置有进液 通道、微阀生成腔、固定腔、限制通道以及出液通道；所述限制通道的高度小于所述固定腔 的高度和/或所述限制通道的宽度小于所述固定腔的宽度。 2.依据权利要求1所述的无泵固定斑马鱼微流体芯片系统，其特征是，所述光敏水凝 胶在波长为308～365nm的紫外‑可见光下发生交联反应凝结成胶。 3.依据权利要求1或2所述的无泵固定斑马鱼微流体芯片系统，其特征是，所述光敏 水凝胶由8％‑18％W/V聚乙二醇二丙烯酸酯和0.03％‑0.1％W/V光引发剂混合制得。 4.依据权利要求1所述的无泵固定斑马鱼微流体芯片系统，其特征是，所述进液通 道、所述微阀生成腔、所述固定腔、所述出液通道的高度为500～1000μm，宽度为800～1500μ m。 5.依据权利要求1所述的无泵固定斑马鱼微流体芯片系统，其特征是，所述限制通道 的高度为150～600μm，宽度为100～250μm。 6.依据权利要求1所述的无泵固定斑马鱼微流体芯片系统，其特征是，所述微型结构 单元在所述限制通道和所述出液通道之间还设置有活动腔。 7.权利要求1至6任一项所述的斑马鱼微流控芯片系统的制备方法，其特征是，包括 以下步骤： (1)使用权利要求1至6任一项所述的输送装置向权利要求1至6任一项所述的所述斑马 鱼微流控芯片的进液通道中注水，除去气泡； (2)将斑马鱼样品装载进所述斑马鱼微流控芯片的固定腔中，向所述斑马鱼微流控芯 片的微阀生成腔中灌注权利要求1至6任一项所述的光敏水凝胶，在权利要求1至6任一项所 述的光源装置下曝光，直至所述光敏水凝胶凝结成胶，灌注E3培养基； (3)接入分析装置，即得。 8.依据权利要求7所述的制备方法，其特征是，步骤(2)中所述斑马鱼样品包括斑马 鱼幼苗、斑马鱼卵。 9.权利要求1至6任一项所述的斑马鱼微流控芯片系统在药物筛选中的应用。 2 2 CN 112452362 B 说明书 1/10页 一种无泵固定斑马鱼微流体芯片系统及其制备方法与应用 技术领域 [0001] 本发明涉及微流控芯片技术领域，具体涉及一种无泵固定斑马鱼微流体芯片系统 及其制备方法与应用。 背景技术 [0002] 斑马鱼因其透明性高、渗透性强，体积小、易操作等特点已被普遍的使用于脊椎动物 生命系统、复杂疾病以及药物筛选等众多研究当中。其中，针对斑马鱼的操控和成像，是实 现各项研究的重要使能技术之一。 [0003] 现有针对斑马鱼的操控，传统方法主要为琼脂糖人工包埋，但使用琼脂糖人工包 埋，不仅操作繁琐、通量低，而且容易引入人为误差。因此，怎么来实现长期的斑马鱼固定和培 养，是斑马鱼相关研究的关键难题之一。 [0004] 目前，针对斑马鱼的自动化固定，主要为气动微阀固定，其由两层薄片(PDMS片)组 成，由上层PDMS片与下层PDMS片经过外力封合后形成具有密闭通道的微阀以调节固定压力 或流体流量。但气动微阀制备复杂，需要气体输入控制装置，操作极其不便，而且还容易对 斑马鱼造成损伤，构建成功率低；美国MIT开发的VAST系统通过一根微管的轴心绕动，可以 实现对麻醉斑马鱼的定位成像，但其长期的麻醉处理对斑马鱼的各项研究，尤其是对大脑 神经的研究会造成极大的干扰；ZEBRA系统通过微结构和流体动力学可以在一定程度上完成对斑马鱼幼 苗的分流和粗糙固定，但其没办法实现定向固定，且仍旧需要持续性水流以及没办法实现高通 量。 [0005] 因此，亟待开发一种可行有效的无泵固定斑马鱼微流体芯片系统，其对于斑马鱼 相关研究和开放应用具有很重要的意义。 发明内容 [0006] 本发明的目的是提供一种斑马鱼微流控芯片； [0007] 本发明的另一目的是提供一种无泵固定斑马鱼微流体芯片系统； [0008] 本发明的另一目的是提供上述斑马鱼微流控芯片系统的制备方法； [0009] 本发明的另一目的是提供上述的斑马鱼微流控芯片或上述的斑马鱼微流控芯 片系统在药物筛选中的应用。 [0010] 本发明所采取的技术方案是： [0011] 本发明的第一个方面，提供： [0012] 一种斑马鱼微流控芯片，该斑马鱼微流控芯片具有若干个微型结构单元； [0013] 上述微型结构单元依次设置有进液通道、微阀生成腔、固定腔、限制通道以及出液 通道； [0014] 上述限制通道的高度小于上述固定腔的高度和/或上述限制通道的宽度小于上述 固定腔的宽度。 [0015] 上述固定腔和限制通道通过高度差和/或宽度差，使斑马鱼幼苗在流体力学的持 3 3 CN 112452362 B 说明书 2/10页 续作用，自动化部分固定于固定腔和限制通道内(固定腔大多数都用在固定斑马鱼幼苗头部)。 [0016] 上述微阀生成腔位于固定腔前端，用于灌注光敏水凝胶，并在上述微阀生成腔内 曝光凝结成胶，从而形成常闭型微阀，对斑马鱼幼苗或鱼卵实现无泵固定。 [0017] 上述斑马鱼微流控芯片采用背部向上式定向固定斑马鱼，可用于采集头部信息 (观测大脑神经信号)和行为学运动；或采用侧向对上述斑马鱼微流控芯片进行成像，可用 于观察心脏、血管的器官的生理情况。 [0018] 进一步地，上述进液通道、上述微阀生成腔、上述固定腔、上述出液通道的高度均 为500～1000μm，宽度为800～1500μm。该高度和宽度均能保证斑马鱼幼苗(5～8dpf)能畅通 无阻地通过。且上述微阀生成腔与上述进液通道的连接处均设计成半径为100～150μm的圆 弧，以确保斑马鱼幼苗能顺利地进入每一个固定腔并避免急锐的转弯造成斑马鱼幼苗身体 的划伤。 [0019] 在本发明的实施例中，固定腔被设计成锥形以更好的固定头部。 [0020] 在本发明的实施例中，从俯视视角来看，上述固定腔的高度随着上述固定腔内的 锥形结构逐渐降低，紧接着为细长的限制通道，用于固定幼鱼的尾部。 [0021] 进一步地，上述限制通道的高度为150～600μm，宽度为100～250μm。 [0022] 进一步地，上述微型结构单元在上述限制通道和上述出液通道之间还设置有活动 腔。 [0023] 在本发明实施例中，具体展示了如图1所示的三种斑马鱼微流控芯片，但本发明所 请求保护的斑马鱼微流控芯片包括但不仅限于如图1所示的三种。 [0024] 在本发明的一个实施例中，上述斑马鱼微流控芯片具有若干个微型结构单元，每 个微型结构单元依次设置有进液通道、微阀生成腔、固定腔、限制通道以及出液通道。上述 进液通道、上述微阀生成腔、上述出液通道的高度均为500～600μm，宽度为900～1000μm。上 述进液通道和上述微阀生成腔连接处设置为半径为100～150μm的圆弧。上述固定腔为锥 形，宽度顺流体流动方向由900～1000μm缩窄至250～200μm，高度为500～600μm。上述固定 腔尾端连接上述限制通道，上述限制通道宽度顺流体流动方向由250～200μm缩窄至150～ 100μm，以符合斑马鱼尾部的结构特点，起到更好的固定作用。上述限制通道高度为500～ 600μm。 [0025] 在本发明的另一个实施例中，上述斑马鱼微流控芯片具有若干个微型结构单元， 每个微型结构单元依次设置有进液通道、微阀生成腔、固定腔、限制通道以及出液通道。上 述进液通道、上述微阀生成腔、上述出液通道的宽度均为900～1000μm，高度为800～900μm。 上述进液通道和上述微阀生成腔连接处设置为半径为100～150μm的圆弧。上述固定腔高度 顺流体流动方向逐渐降低(由800～900μm降低至200～300μm)，因此，其在侧视图中呈现为 锥形结构，上述固定腔宽度为900～1000μm。上述固定腔尾端连接上述限制通道，上述限制 通道高度顺流体流动方向由200～300μm降低至100～150μm，长为4mm，宽度为900～1000μm， 以确保只能允许尾巴通过。上述腔室设计对斑马鱼的侧向固定是至关重要的。 [0026] 在本发明的另一个实施例中，上述斑马鱼微流控芯片具有若干个微型结构单元， 每个微型结构单元依次设置有进液通道、微阀生成腔、固定腔、限制通道、活动腔以及出液 通道。上述进液通道、上述微阀生成腔、上述出液通道的高度均为500～600μm，宽度为900～ 1000μm。上述进液通道和上述微阀生成腔连接处设置为半径为100～150μm的圆弧。上述固 4 4 CN 112452362 B 说明书 3/10页 定腔为锥形，宽度顺流体流动方向由900～1000μm缩窄至250～300μm，高度为500～600μm。 上述固定腔尾端连接上述限制通道，上述限制通道长300～450μm，宽250～300μm，高500～ 600μm。上述限制通道尾端连接上述活动腔，上述活动腔呈扇形(正视图)，上述扇形半径为 2.5～3mm，以足够让斑马鱼在此处展现各种不同的运动状态(如J型弯曲、C型弯曲等)，上述 活动腔高度为500～600μm。 [0027] 上述活动腔可用于观察斑马鱼幼苗尾部活动。 [0028] 上述斑马鱼微流控芯片的制备方法可采用基于高精度计算机数控(CNC)加工或者 3D打印等本领域常规技术制备得到。 [0029] 在本发明的实施例中，上述斑马鱼微流控芯片是利用聚二甲基硅氧烷(PDMS)通过 从模具上复制微流体中空通道来制备得到的。 [0030] 本发明的第二个方面，提供： [0031] 一种无泵固定斑马鱼微流体芯片系统，该无泵固定斑马鱼微流体芯片系统包括输 送装置、上述的斑马鱼微流控芯片、光敏水凝胶、光源装置、分析装置； [0032] 其中，上述光敏水凝胶用于固定斑马鱼幼苗或斑马鱼鱼卵。 [0033] 上述光源装置包含紫外光照射装置。 [0034] 进一步地，上述光敏水凝胶在波长为308～365nm的紫外‑可见光下发生交联反应 凝结成胶。上述紫外‑可见光优选为紫外光，更优选地，上述紫外光的波长为365nm。 [0035] 进一步地，上述光敏水凝胶由8％‑18％W/V聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)和 0.03％‑0.1％W/V光引发剂混合制得。 [0036] 上述光引发剂包括Irgacure 2959。 [0037] 上述光敏水凝胶中PEGDA和光引发剂的特定用量配比能够在波长为365nm的紫外 光照射下快速凝结成胶(凝结成胶时间≤10s)。 [0038] 目前对斑马鱼的微操控和固定基本都实施了琼脂糖人工包埋、持续性水流注射或 长期麻醉处理，操控过程过于繁琐导致费时费力，并且难以移动样品，而且由于人为操控， 琼脂糖固化温度以及麻醉处理等处理导致对实验和应用结果引入过多误差及不确定性，本 发明提供的斑马鱼微流控芯片系统，使其可以在不进行长期麻醉处理和持续性水流注射的 情况下，通过流体动力学方法，微结构设计和凝胶微阀阻隔的结合，实现对斑马鱼的自动化 固定。 [0039] 而且传统的用于固定小动物的含阀微流控芯片结构和外部系统都相对复杂，使其 大规模的商业化生产和实际使用受到限制，并且严重阻碍了高通量的实现。本发明提供的 斑马鱼微流控芯片系统是基于常闭型微阀和微流控芯片的联合，通过结构的合理的布局， 实现斑马鱼自动化、无泵固定和高通量筛选。 [0040] 本发明的第三个方面，提供： [0041] 上述斑马鱼微流控芯片系统的制备方法，包括以下步骤： [0042] (1)使用上述的输送装置向上述的斑马鱼微流控芯片的进液通道中注水，除去上 述斑马鱼微流控芯片中的气泡； [0043] (2)将斑马鱼样品装载进上述斑马鱼微流控芯片的固定腔中，向上述斑马鱼微流 控芯片的微阀生成腔中灌注上述的光敏水凝胶，在上述的光源装置下曝光，直至上述光敏 水凝胶凝结成胶，灌注E3培养基； 5 5 CN 112452362 B 说明书 4/10页 [0044] (3)接入上述的分析装置，即得。 [0045] 上述光敏水凝胶的灌注速度为12‑15mL/h。 [0046] 上述光敏水凝胶凝结成胶后灌注E3培养基可冲洗掉别的部位的光敏性水凝胶溶 液，由于光敏性水凝胶凝胶后的收缩性，所形成的的凝胶微阀占据了微流通道的大部分空 间但不会紧贴通道内壁，因此凝胶微阀四周缝隙可以为后续各种微流体的通过提供了可能 性。 [0047] 进一步地，上述步骤(2)中斑马鱼样品包括斑马鱼幼苗、斑马鱼卵。 [0048] 本发明的第四个方面，提供： [0049] 上述的斑马鱼微流控芯片或上述的斑马鱼微流控芯片系统在药物筛选中的应用。 [0050] 当然，根据实际的需求，本发明中的生理信息采集筛选系统可应用于本领域中的生 物医学基础研究中。 [0051] 本发明的有益效果是： [0052] 1.本发明采用无泵固定(传统微流控芯片固定难以脱离持续泵流)，对于斑马鱼高 通量实验来说，本发明在操作上更简单、经济，易于推广应用。 [0053] 2.本发明可以在不进行凝胶包埋或麻醉处理的情况下，能够使大量的斑马鱼幼鱼 实现自动定向和部分固定，平均可以将固定斑马鱼的时间相较传统手动方法缩短60倍。 [0054] 3.本发明提供了一个高通量、自动化、无泵固定的斑马鱼操控芯片及其配合使用 的系统，为进一步实现复杂疾病治疗药物的研发，以及斑马鱼相关研究提供了极具潜力的 技术上的支持。 附图说明 [0055] 图1为实施例1(A)、实施例2(B)和实施例3(C)中不同的微流控芯片的设计示意图； [0056] 图2为实施例1中的微流控芯片的斑马鱼幼苗自动装载和定向固定示意图； [0057] 图3为本发明实施例中的光敏凝胶微阀形成示意图； [0058] 图4为本发明实施例中形成的光敏凝胶微阀在微流道中的实际效果图； [0059] 图5为本发明实施例中的基于凝胶微阀的微流控芯片流体动力学仿线为斑马鱼鱼卵无泵定向固定于微流控芯片中的效果图，其中A为含有异硫氰酸 荧光素(FITC)的光敏水凝胶溶液凝胶后在荧光显微镜下(激发光：420～485nm)的图像，B为 光敏水凝胶溶液凝胶后的眀场图像； [0061] 图7为斑马鱼幼苗在基于凝胶微阀的微流控芯片中的流体动力学仿线为斑马鱼幼苗无泵定向固定于微流控芯片中的效果图，其中B、D为含有异硫氰 酸荧光素(FITC)的光敏水凝胶溶液凝胶后在荧光显微镜下(激发光：420～485nm)的图像(B 为斑马鱼正面，D为斑马鱼侧面)，A、C为光敏水凝胶溶液凝胶后的眀场图像(A为斑马鱼正 面，C为斑马鱼侧面)； [0063] 图9为本发明斑马鱼微流控芯片系统对斑马鱼幼苗无泵定向固定得到的心脏、血 管、大脑、骨髓生理信息采集结果； [0064] 图10为本发明斑马鱼微流控芯片系统在戊四唑(PTZ)和精氨酸(L‑Arginine)药物 浓度在体筛选结果，其中，A为0mM、5mM、10mM、15mM浓度戊四唑环境下的斑马鱼幼苗尾部活 动图；B为0mM、5mM、10mM、15mM浓度戊四唑环境下的尾巴、眼睛、嘴巴的运动情况；C为0mM、 6 6 CN 112452362 B 说明书 5/10页 0.001mM、1mM、10mM浓度精氨酸环境下的斑马鱼幼苗尾部活动图；D为0mM、0.001mM、1mM、 10mM浓度精氨酸环境下的尾巴、眼睛、嘴巴的运动情况； [0065] 图11为斑马鱼幼苗琼脂糖手动固定效果图； [0066] 图12为水凝胶的全包埋处理过程(0min、5min、10min、15min、20min、25min)中的斑 马鱼幼苗形态(A)，水溶液(对照)和水凝胶溶液中的斑马鱼幼苗形态(B)，以及对照组、本发 明斑马鱼微流控芯片系统和水凝胶溶液中的斑马鱼幼苗形态(C)。 具体实施方式 [0067] 为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施 方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书里面描述的具体实施方式仅仅 是为了解释本发明，并非为了限定本发明。 [0068] 所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材 和试剂。 [0069] 本发明实施例中使用的聚二甲基硅氧烷(PDMS)购自本发明实施例中使用的聚二 甲基硅氧烷(PDMS)购自广州晨生生物制品有限公司(DOW CORNING SYLGARD  184)，包括预 聚物A和交联剂B两部分。 [0070] 基于凝胶微阀的斑马鱼微流控芯片的制备 [0071] 本发明所述的基于凝胶微阀的斑马鱼微流控芯片，具体结构如下： [0072] 该斑马鱼微流控芯片由多个微型结构单元组成，每一个微型结构单元都依次设置 有进液通道、微阀生成腔、固定腔、限制通道以及出液通道。 [0073] 上述限制通道的高度小于上述固定腔的高度和/或上述限制通道的宽度小于上述 固定腔的宽度，从而基于流体力学的持续作用，实现斑马鱼幼苗的自动化部分固定。所述微 阀生成腔位于固定腔前端，光敏水凝胶在微阀生成腔内通过紫外光曝光凝结成胶从而形成 常闭型微阀，从而对斑马鱼幼苗实现自动化、无泵固定和高通量筛选。 [0074] 其中，上述限制通道的高度小于上述固定腔的高度和/或上述限制通道的宽度小 于上述固定腔的宽度，以实现斑马鱼幼苗的自动化部分固定的技术效果(固定腔大多数都用在 固定斑马鱼幼苗头部，限制通道大多数都用在限制斑马鱼尾部活动)。 [0075] 实施例1一种基于凝胶微阀的斑马鱼微流控芯片及其制备方法 [0076] 实施例1中的斑马鱼微流控芯片如图1A所示，所述斑马鱼微流控芯片由多个微型 结构单元组成，每一个微型结构单元都依次设置有进液通道、微阀生成腔、固定腔、限制通 道以及出液通道。 [0077] 进液通道、微阀生成腔以及出液通道的宽度均为900μm。 [0078] 进液通道、微阀生成腔、出液通道的高度均为500μm。 [0079] 微阀生成腔位于固定腔前端，固定腔被设计成锥形以更好的固定头部，高度为500 μm，其中锥形固定腔长度为1.4mm，锥形固定腔宽度顺流体流动方向由900μm缩窄至210μm。 微阀生成腔长度为4.24mm。 [0080] 所述进液通道设置在所述微流控基片的一端，所述出液通道设置在所述微流控基 片的另一端；所述进液通道和出液通道与所述反应通道的连接处均为圆角，所述圆角半径 为150μm。 7 7 CN 112452362 B 说明书 6/10页 [0081] 锥形固定腔尾部连接有限制通道，限制通道宽度顺流体流动方向由210μm缩窄至 150μm，以符合斑马鱼尾部的结构特点，起到更好的固定作用。限制通道高度为500μm。 [0082] 实施例1中所述的一种基于凝胶微阀的斑马鱼微流控芯片采用聚二甲基硅氧烷 (PDMS)通过从模具上复制斑马鱼微流控芯片中的微流体中空通道制备得到。 [0083] 具体步骤为： [0084] 制备模具：利用CNC数字控制机床在铜板上来加工；清洗模板，先把已加工好的铜板 用无水乙醇浸泡一晚，然后拿镊子夹住酒精棉片轻轻擦拭铜板，去除角落和缝隙的污渍，然 后超声清洗20min，并用吹干，完成微流控芯片模板的制备。 [0085] 将PDMS(预聚物A)和PDMS(交联剂B)按10:1的比例放入同一容器中，充分均匀搅拌 后，在室温下脱去真空去除气泡。随后将混合好的PDMS倒在清洗好的铜模板上，再次抽真空 完全除尽气泡。放入烘箱80℃，烘烤4‑6h。待PDMS完全固化后，取出并冷却至室温，再将其从 模具上脱下来，根据入口和出口的位置用打孔器进行打孔。 [0086] 按照设计的微流控芯片尺寸，采用本领域常规方法制备玻璃微流控底片； [0087] 用等离子处理PDMS微流控芯片基片和玻璃盖片的结合面后，将二者结合在一起， 完成微流控芯片的制备。 [0088] 本实施例所制备得到的基于凝胶微阀的斑马鱼微流控芯片为背部向上式定向固 定斑马鱼的微流控芯片，可用于采集头部信息(观测大脑神经信号)和行为学运动。如图2所 示，基于该斑马鱼微流控芯片的自动装载和定向固定图。 [0089] 实施例2一种基于凝胶微阀的斑马鱼微流控芯片及其制备方法 [0090] 实施例2中的斑马鱼微流控芯片如图1B所示，所述斑马鱼微流控芯片由多个微型 结构单元组成，每一个微型结构单元都依次设置有进液通道、微阀生成腔、固定腔、限制通 道以及出液通道。 [0091] 所述进液通道设置在所述微流控基片的一端，所述出液通道设置在所述微流控基 片的另一端；所述进液通道和出液通道与所述反应通道的连接处均为圆角，所述圆角半径 为150μm。 [0092] 进液通道、微阀生成腔、出液通道的宽度均为900μm。 [0093] 进液通道、微阀生成腔、固定腔前端的高度均为800μm，固定腔高度顺流体流动方 向逐渐降低(由800μm降低至250μm)，因此，其在侧视图中呈现为锥形结构，固定腔宽度为 900μm，固定腔长度为1mm。微阀生成腔位于固定腔前端。固定腔尾端连接限制通道，限制通 道高度顺流体流动方向由250μm降低至150μm，长为4mm，宽度为900μm，以确保只能允许尾巴 通过。上述腔室设计对斑马鱼的侧向固定是至关重要的。 [0094] 限制通道尾端与出液通道连接，所述出液通道高度为150μm。 [0095] 本实施例中的微流控芯片的制备方法如实施例1所示。 [0096] 本实施例所制备得到的基于凝胶微阀的斑马鱼微流控芯片为侧面向上式定向固 定斑马鱼的微流控芯片，可用于观察心脏、血管的器官的生理情况。侧面向上式的芯片相当 于将头部向上式的微流控芯片结构在三维空间中沿着XZ平面旋转90°从而使得斑马鱼幼苗 侧面向上的形态。 [0097] 实施例3一种基于凝胶微阀的斑马鱼微流控芯片及其制备方法 [0098] 实施例3中的斑马鱼微流控芯片如图1C所示，所述斑马鱼微流控芯片由多个微型 8 8 CN 112452362 B 说明书 7/10页 结构单元组成，每一个微型结构单元都依次设置有进液通道、微阀生成腔、固定腔、限制通 道、活动腔以及出液通道。 [0099] 进液通道、微阀生成腔、出液通道的宽度均为900μm，高度均为500μm。 [0100] 所述进液通道设置在所述微流控基片的一端，所述出液通道设置在所述微流控基 片的另一端；所述进液通道和出液通道与所述反应通道的连接处均为圆角，所述圆角半径 为150μm。 [0101] 固定腔为锥形，宽度顺流体流动方向由900μm缩窄至260μm，高度为500μm。固定腔 尾端连接限制通道，限制通道的长度为420μm，宽度为260μm，高度为500μm。 [0102] 限制通道尾端连接活动腔，活动腔顺流体流动方向发散为扇形(正视图)，活动腔 的半径为2.5mm，以足够让斑马鱼在此处展现各种不同的运动状态(如J型弯曲、C型弯曲 等)，活动腔高度为500μm。 [0103] 本实施例中的微流控芯片的制备方法如实施例1所示。 [0104] 本实施例所制备得到的基于凝胶微阀的斑马鱼微流控芯片为带有活动腔的微流 控芯片，可同时用于观测大脑神经信号和行为学等信息。 [0105] 实施例4光敏凝胶的制备与灌注 [0106] 本发明中的基于凝胶微阀的斑马鱼微流控芯片采用光敏凝胶的成胶方法，在微流 控芯片微阀生成腔内形成凝胶微阀。如图3所示，当斑马鱼被部分固定于芯片内固定腔后， 通过将光敏凝胶溶液以一定的流速(12‑15mL/h)灌注整个芯片，在微阀生成腔局部降温或 照射(365nm紫外光照射，反应时间≤10秒)，形成常闭型凝胶微阀，然后灌注E3培养基冲掉 未成胶的光敏凝胶，以此来实现将斑马鱼幼苗自动化、无泵化固定在芯片内以供相关研究。 [0107] 本发明通过采用8％‑18％W/V聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)和0.03％‑0.1％W/V光 引发剂Irgacure 2959混合制备光敏凝胶溶液，发明人发现，光敏凝胶溶液处于同一浓度配 比情况下时，紫外波长越短能量越高能更加有效地使光敏水凝胶交联，从而使本发明中提 供的凝胶方法能够在极短的时间内对特定部位进行成胶。如图4和5所示，由于凝胶后的收 缩性，所形成的的凝胶微阀占据了微流通道的大部分空间但不会紧贴通道内壁，因此四周 缝隙为后续各种微流体的通过提供了可能性。 [0108] 实施例5一种无泵固定斑马鱼微流体芯片系统 [0109] 本实施例中的无泵固定斑马鱼微流体芯片系统最重要的包含实施例1中的微流控芯 片、斑马鱼自动装载装置(包括各类输送装置)、成胶系统(包括光敏水凝胶、光源装置)、药 物注射模块、与计算机相连的光学显微镜(分析装置)。其中，微流控芯片和成胶系统的结合 是该系统的核心技术，也是斑马鱼无泵化固定和自动化操控至关重要的部分。药物添加通 过双通道注射泵控制流速来实现，显微镜配有高清摄像头用于在研究过程中捕捉斑马鱼幼 鱼的图像和视频。 [0110] 本实施例中的无泵固定斑马鱼微流体芯片系统在以斑马鱼鱼卵为样品时的具体 装配方式为： [0111] 将微流控芯片入口与外部用于控制斑马鱼鱼卵运输的控制管理系统相连，出口接入循 环系统或废液箱。在斑马鱼鱼卵装载之前，首先向芯片入口注水并充满整个通道，除去气 泡。利用流体动力学的原理，芯片将自动化地将斑马鱼鱼卵有序地装载到每一个固定腔室 中。在完成鱼卵装载后，在入口以10～15mL/h的流速向腔室内灌注光敏凝胶溶液，并利用成 9 9 CN 112452362 B 说明书 8/10页 胶系统形成常闭型凝胶微阀。紧接着，用E3培养基冲洗掉未成胶的溶液，在无泵持续施加水 流正压的情况下，将保持活着的斑马鱼鱼卵以阵列的形式稳固地固定在正确的位置来完成 后续的研究和应用，效果图如图6所示。 [0112] 实施例6一种无泵固定斑马鱼微流体芯片系统 [0113] 本实施例中的无泵固定斑马鱼微流体芯片系统如实施例5所示。 [0114] 本实施例中的无泵固定斑马鱼微流体芯片系统在以斑马鱼幼苗为样品时的具体 装配方式为： [0115] 将微流控芯片入口与外部用于控制斑马鱼幼苗运输的控制管理系统相连，出口接入循 环系统或废液箱。在斑马鱼幼苗装载之前，首先向芯片入口注水并充满整个通道，除去气 泡。如图7所示，利用流体动力学的原理，芯片将自动化地将斑马鱼幼苗有序地装载到每一 个固定腔室中。在完成斑马鱼幼苗装载后，在入口以10～15mL/h的流速向腔室内灌注光敏 凝胶溶液，并利用成胶系统来进行紫外曝光5～10s，形成常闭型凝胶微阀。紧接着，用E3培养 基冲洗掉未成胶的溶液，在无泵持续施加水流正压的情况下，将斑马鱼幼苗以阵列的形式 稳固地以特定方向(垂直或平行等)固定在设计好的位置上来完成相应的研究和应用，效果 图如图8所示。 [0116] 实施例7基于凝胶微阀的斑马鱼微流控芯片和无泵固定斑马鱼微流体芯片系统在 斑马鱼幼苗脑部、心脏、血管等生理信息的采集中的应用 [0117] 本实施例将无泵固定斑马鱼微流体芯片系统与实施例1～3中的斑马鱼微流控芯 片进行联合使用，包括用来观察大脑、眼睛、嘴巴等器官的背面向上式的微流控芯片(实施 例1和3)和观察心脏、血管等器官的侧面向上式的微流控芯片(实施例2)，实现对斑马鱼幼 苗在多个方向上的无泵固定，以采集不同生理结构的信息参数 [0118] 无泵固定斑马鱼微流体芯片系统的具体装配方式如实施例6所示。 [0119] 不同生理结构的信息参数采集结果如图9所示，将无泵固定斑马鱼微流体芯片系 统与实施例1～3中的斑马鱼微流控芯片进行联合使用后，可以成功的采集到斑马鱼幼苗的 心脏、血管、大脑、骨髓等生理信息。 [0120] 实施例8基于凝胶微阀的斑马鱼微流控芯片和无泵固定斑马鱼微流体芯片系统在 药物浓度筛选测试中的应用 [0121] 本实施例分别利用本发明中实施例3中的斑马鱼微流控芯片和实施例6中的无泵 固定斑马鱼微流体芯片系统，进行不同浓度梯度的戊四唑(PTZ)和精氨酸(L‑Arginine)的 在体筛选。 [0122] 首先，使用实施例3中的斑马鱼微流控芯片完成斑马鱼幼苗的自动化装载；紧接 着，使用光敏凝胶在斑马鱼头部的特定部位生成凝胶微阀完成无泵式固定，随后向微流控 芯片内灌注E3培养基，冲洗掉别的部位的光敏凝胶溶液，连续灌注并持续一段时间以尽可 能减少凝胶溶液的残留，然后分别向芯片内注射不同浓度的戊四唑溶液(5mM、10mM、15mM) 或精氨酸溶液(0.001mM、1mM、10mM)，以E3培养基作为对照组，在10倍镜头下(曝光时间： 200ms)记录斑马鱼幼鱼的行为学变化(10min)，结果如图10所示。 [0123] 戊四唑是斑马鱼癫痫模型中最常用的癫痫诱导剂，能在短时内使斑马鱼产生惊 厥，除了记录大脑活动图谱以监测惊厥发作时的神经元活动外，最直观的方法就是记录尾 巴、眼睛、嘴巴的运动情况。使用戊四唑诱导斑马鱼幼苗癫痫发作，斑马鱼幼苗尾巴的运动 10 10 CN 112452362 B 说明书 9/10页 会最明显，并会与对照组存在非常明显性差异(p0.05)。而精氨酸作为斑马鱼的嗅觉刺激物， 相较于尾巴的摆动，嘴巴和眼睛的运动反应则更加强烈。在本实施例结果中，不难发现，戊 四唑在10mM的浓度下所引起的斑马鱼癫痫症状最明显；而精氨酸在1mM的作用浓度下能 引起最明显的斑马鱼嘴部活动。该结果展现出本发明提供的基于凝胶微阀的无泵固定微 流体系统的可行性和稳定能力，并极具扩展性(扩展到更多种类的药物测试和筛选)和经济性 (微量药物注射即可，不需要持续灌注)，为大规模、高通量的药物筛选提供的技术支撑。 [0124] 对比例1现存技术与本发明中的斑马鱼微流控芯片系统的斑马鱼固定能力对比 [0125] 参与对比的现有的斑马鱼固定技术包括： [0126] 1.直接对斑马鱼进行麻醉(MS222麻醉)； [0127] 2.采用琼脂糖凝胶或其他凝胶对斑马鱼做固定(手动琼脂糖包埋)； [0128] 3.ZEBRA技术； [0129] 4.VAST技术； [0130] 5.Fish‑trap技术。 [0131] 对比项目为自动化程度、要不要麻醉、通量程度还有是不是需要微流泵辅助。 [0132] 结果如下表所示。 [0133] 表1现存技术与本发明中的斑马鱼微流控芯片系统的斑马鱼固定能力对比表 [0134] [0135] 如表1所示，本发明的斑马鱼微流控芯片系统相比其他现存技术，不需要手动地去 固定斑马鱼；此外，现有的利用微流控技术对斑马鱼做固定大多是基于流体动力学，虽然 简单易实现，但是持续性地注射水流不仅会在长时间的实验观察中带来不便而且也增加了 样品和试剂的消耗，而本发明的无泵式固定技术则抛开了传统长时间的微流体灌注，简化 了系统架构的同时也大幅度减少了试剂消耗。最重要的是，本发明的斑马鱼微流控芯片系统 不再会有人工的包埋技术中难以达到定向固定的问题(图11)，在完成斑马鱼自动化装载和 定向的同时，实现了斑马鱼无泵式固定，具有强大的拓展性。 [0136] 对比例2本发明斑马鱼微流控芯片系统与现有水凝胶固定技术的对比试验 [0137] 分别使用本发明斑马鱼微流控芯片系统与现有水凝胶固定技术对斑马鱼幼苗进 行固定试验。 [0138] 结果如图12所示。如图12A和12B所示，进行水凝胶的全包埋处理过程中(0min、 5min、10min、15min、20min、25min)，由于现有水凝胶固定技术在成胶过程中所产生的应力 变化会对斑马鱼造成一定程度的挤压，导致其相对脆弱的部位的损伤，比如脊柱扭曲，眼球 破裂等。其次，如图12C所示，采用现有的水凝胶固定技术对斑马鱼做固定通常需要人为 地进行包埋处理，且难以达到定向固定的效果，而本发明的斑马鱼微流控芯片系统则可通 过芯片的特殊结构定向地无泵化固定斑马鱼,并且不会对斑马鱼造成上述的伤害，相比较 而言，本发明中的斑马鱼微流控芯片系统是已报道的水凝胶包埋固定技术没办法替代的，并 且具备一定的应用优势。 11 11 CN 112452362 B 说明书 10/10页 [0139] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围以内。 12 12 CN 112452362 B 说明书附图 1/10页 图1 13 13 CN 112452362 B 说明书附图 2/10页 图2 14 14 CN 112452362 B 说明书附图 3/10页 图3 图4 15 15 CN 112452362 B 说明书附图 4/10页 图5 16 16 CN 112452362 B 说明书附图 5/10页 图6 17 17 CN 112452362 B 说明书附图 6/10页 图7 图8 18 18 CN 112452362 B 说明书附图 7/10页 图9 19 19 CN 112452362 B 说明书附图 8/10页 图10 20 20 CN 112452362 B 说明书附图 9/10页 图11 21 21 CN 112452362 B 说明书附图 10/10页 图12 22 22

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